Торчинский дмитрий: К хищениям в Ново-Огарево добавили пять лет – Происшествия – Коммерсантъ

ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021

Вид деятельности ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021: Оптовая торговля, включая торговлю через агентов, кроме торговли автотранспортными средствами и мотоциклами

ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021: адрес, телефон, факс, email, сайт

Регион: г. Чебоксары, Республика Чувашия

Телефон: нет данных

Факс: нет данных

E-mail: нет данных

Сайт: нет данных

График работы: Пн-Пт: 9-18, Сб-Вс: 11-17

Тип: Индивидуальный предприниматель

Регистрация ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021:Дата первичной регистрации – 19 июня 2008 года.
Регистратор – Инспекция Федеральной Налоговой Службы по г. ЧЕБОКСАРЫ.

Нашли неточность в описании или хотите указать больше информации о компании? — Напишите нам!

Подробная информация об ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021: бухгалтерия, баланс. Скачать банковские реквизиты, тендеры, кредитную историю, налоги ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021.

ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021 реквизиты: ОГРНИП, ИНН, ОКПО, ОКАТО

ОГРНИП: 308213017100062

ИНН: 212914382319

ОКПО: 157726061

ОКАТО: 97401371000

Получить выписку из ЕГРИП об ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021

Виды деятельности по ОКВЭД:
Оптовая торговля, включая торговлю через агентов, кроме торговли автотранспортными средствами и мотоциклами
Оптовая торговля прочими машинами и оборудованием
Оптовая торговля прочими машинами, приборами, оборудованием общепромышленного и специального назначения

Работа в

ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021 вакансии, практика, стажировка, карьера

На данный момент открытых вакансий нет. Возможно вас заинтересуют вакансии в других компаниях:

Монтажник натяжных потолков

Машинист экскаватора, бульдозера

Менеджер по продажам

Мастер маникюра и педикюра

Машинист катка

Фасовщик-упаковщик

Продавец-консультант

Сотрудник торгового зала отдела напитки (Советский район)

Отклики и отзывы ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021

Оставить отклик для ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021 в социальных сетях. Читать отзывы об ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021

Индивидуальный предприниматель Торчинский Дмитрий Владимирович зарегистирован и ведет свою деятельность в регионе г. Чебоксары, Республика Чувашия. Основная деятельность ИП Торчинский Дмитрий Владимирович — Оптовая торговля, включая торговлю через агентов, кроме торговли автотранспортными средствами и мотоциклами. ИП Торчинский Дмитрий Владимирович зарегистрирован в ФНС под номером ОГРНИП: 308213017100062, ИНН: 212914382319. По данным реквизитам можно полную выписку данных из ЕГРИП. Дата первичной регистрации – 19 июня 2008 года.
Регистратор – Инспекция Федеральной Налоговой Службы по г. ЧЕБОКСАРЫ. Сведения об открытых вакансиях отсутствуют

Также смотрите индивидуальных предпринимателей с таким же видом деятельности, как ИП Торчинский Дмитрий Владимирович 2021 конкуренты: Алхименко Геннадий Васильевич | Кузнецов Анатолий Александрович | Медведева Стэлла Кадимовна | Кучапина Светлана Анатольевна | Кабанов Руслан Сергеевич

Культура. «Букеровский» комитет огласил имена членов жюри 2004 года. 6 марта в Лондоне состоится концерт скрипично-фортепьянного дуэта «Крещендо-Руссо», в который входят два молодых москвича

«Букеровский» комитет огласил имена членов жюри 2004 года. Председатель — Владимир Войнович, члены жюри: писатель Андрей Дмитриев, критики Никита Елисеев и Леонид Быков, режиссер-мультипликатор Гарри Бардин.
1 июля будет оглашен длинный список, 2 октября – шорт-лист премии. Награждение победителя — 2 декабря 2004 года.6 марта в Лондоне состоится концерт скрипично-фортепьянного дуэта «Крещендо-Руссо», в который входят два молодых москвича — 23-летний Дмитрий Торчинский (скрипка) и 19-летний Павел Тимофеевский (фортепиано). В их репертуаре — музыка от классики до сочинений XXI века.
Павел Тимофеевский учился в Специальной музыкальной школе имени Перселла в Англии. В 1998 году его Первый струнный квартет исполнялся в Королевской Академии Музыки, он победитель конкурса юных композиторов под эгидой Би-би-си. Дмитрий Торчинский в 2003 году закончил лондонский Королевский музыкальный колледж и вошел в состав организации Live music now!, основанной Иегуди Менухиным. Дуэт Торчинского и Тимофеевского создан в прошлом году.Израильский дом мод «Комильфо» представил свой летний каталог парадом моделей у стены, отделяющей Израиль от палестинских территорий. Идея заключалась в том, чтобы подчеркнуть контраст между агрессивностью стены и красотой моды. Владелица дома мод Сибил Гольдфингер заявила, что пытается таким образом сблизить израильских и палестинских женщин в деле установления мира. «Мы предлагаем хоть что-то, предлагаем надежду на то, что женщины и матери с обеих сторон объединятся и остановят кровопролитие, которое продолжается так долго», — заявила она. Из-за правил, ограничивающих перемещения граждан, найти палестинскую модель для шоу Гольдфингер не смогла. В дефиле участвовали девушки из Франции, Израиля, Польши, России и Словении.8 марта премьерой нового фильма режиссера Сергея Соловьева «О любви» откроется в Москве девятый Международный кинофестиваль «Лики любви». Показ – в
Доме кино. В основе фильма Соловьева – три рассказа Чехова: «Доктор», «Медведь» и «Володя». Роли исполняют Татьяна Друбич, Александр Абдулов, Евгения Крюкова, Александр Збруев, Екатерина Волкова.Петербургское издательство «Образование-Культура» выпустило двухтомник «Ораторы России в Государственной Думе (1906-1917 годы)». Включены речи известных думцев – Владимира Дмитриевича Набокова, Василия Маклакова, Ираклия Церетели, Александра Керенского, Василия Шульгина, Владимира Пуришкевича, Павла Милюкова и других. Том снабжен биографическими справками.

ООО «Стройкомплект», Строительная компания — Организации (компании) Санкт-Петербурга — Канонер

ООО «Стройкомплект» зарегистрировано в 2004 году.

Владельцами ООО «Стройкомплект» являются гендиректор компании Дмитрий Торчинский (50%) и Дмитрий Сергеев (50%).

ООО «Стройкомплект» входит в холдинг «Форум» Дмитрия Михальченко.

Телефон:

309-90-00
Факс:

309-55-11
E-mail:

[email protected]
Сайт:

www.stk-spb.ru
Дата регистрации:

11 июня 2004 года

ОГРН:
1047855015526  

ИНН:
7804300920 

Адрес:

194044, Санкт-Петербург, Пироговская наб., 17, корп. 7, пом. 14н (юрид.)
191002, Санкт-Петербург, ул. Рубинштейна, 13 (факт.)
Руководитель:

Торчинский Дмитрий Николаевич
Связанные личности:

Упоминания в материалах

Взрослую поликлинику на Вербной улице сдадут на год позже

08/07/2015 19:21
Взрослую поликлинику на Вербной улице, 14, достоят на год позже — в конце 2016-го. Такое решение связано с сокращением бюджетного финансирования.

В Пушкине освятили восстановленную Сергиевскую церковь

08/12/2014 18:34
В Пушкине сегодня освятили Сергиевскую церковь в Фуражном переулке, 4/8. В советское время она была перестроена, и внутри размещалась автошкола.

На Вербной улице через год построят взрослую поликлинику

28/11/2014 9:53
На Вербной улице, 14, будет построена новая поликлиника для взрослых. Она должна принять первых пациентов в 2016 году.

Рядом с «Александрией» на Новгородской построят жилой дом

11/07/2014 17:53
Еще один жилой дом планируется построить на Новгородской улице рядом с Единым центром документов. Место для него выбрали на задворках.

Осенью завершат перестройку Сергиевской церкви в Пушкине

02/07/2014 14:32
Осенью планируется завершить реконструкцию церкви Сергия Радонежского в Фуражном переулке, 4, города Пушкина. Ее восстанавливают из автошколы.
Все упоминания в материалах

Primephonic — Плеер для классической музыки

• I.

  Увертюра: Moderato con moto

  Юрий Торчинский

• II. Противоречие: Moderato

  Юрий Торчинский

• III. Народный праздник

  Юрий Торчинский

• IV. Интерлюдия: Адажио —

  Юрий Торчинский

• В.Органный вальс: Аллегретто

  Юрий Торчинский

• VI.

  Галоп: Аллегро

  Юрий Торчинский

• VII. Введение: Андантино

  Юрий Торчинский

• VIII. Романс: Allegro moderato — Andante con moto

  Юрий Торчинский

• IX. Интермеццо: Andante — Moderato — Tempo I

  Юрий Торчинский

• X.Ноктюрн: Moderato

  Юрий Торчинский

• XI.

  Сцена: Модерато

  Юрий Торчинский

• XII. Финал: Allegro non troppo — Allegro vivace — Moderato con moto

  Юрий Торчинский

Торчинский, Юрий [WorldCat Identities]

BBC Proms (
Визуальный
)
1
издание опубликовано

в
1998 г.
в
английский
и проводится
186 Член WorldCat

библиотеки

по всему миру

С такой же веселой атмосферой Last Night классическая музыка начинает свой уравновешенный образ, когда дирижирует Ян Паскаль Тортелье.
Филармонический оркестр BBC на выпускном концерте музыки из популярного репертуара.От темы розовой пантеры до болеро
и Кармен, музыка была специально отобрана для детей всех возрастов. И для грандиозного финала есть
захватывающий фейерверк
Музыка к фильму
Эрих Вольфганг Корнгольд (
Запись
)
2
изданий опубликовано

в
2005 г.
и проводится
80 член WorldCat

библиотеки

по всему миру

Щелкунчик
Петр Ильич Чайковский (
Визуальный
)
1
издание опубликовано

в
1994 г.
в
английский
и проводится
47 член WorldCat

библиотеки

по всему миру

Постановка Питера Райта из балета «Щелкунчик» в Ковент-Гардене.
Николай Римский-Корсаков автор:
Николай Римский-Корсаков (
Запись
)
1
издание опубликовано

в
2007 г.
и проводится
8 член WorldCat

библиотеки

по всему миру

Проф.

Юваль Эбенштейн | Тель-Авивский университет

Определение количества фемтограмм дцДНК путем подсчета одиночных молекул | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Современные приложения молекулярной биологии вновь вызывают интерес к измерению мельчайших количеств ДНК. В этой работе мы используем визуализацию одиночных молекул с калибровкой размера in situ для точного анализа размера и массового распределения образцов ДНК. Мы используем корреляцию между длиной ДНК и интенсивностью ее флуоресценции после окрашивания, чтобы оценить длину отдельных фрагментов ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Стандарты синтетической эталонной ДНК добавляются к исследуемому образцу перед окрашиванием и служат в качестве внутренних калибраторов размера, поддерживая надежный анализ для точного определения размера ДНК.Наши результаты демонстрируют способность реконструировать точное распределение длин в сложном образце ДНК путем определения размеров подмножества, содержащего только фемтограммные количества ДНК, что, таким образом, превосходит микрофлюидный гель-электрофорез, который в настоящее время является признанным золотым стандартом. Этот анализ может найти полезные приложения для генетического анализа, когда точное распределение молекул ДНК по размеру имеет решающее значение, а доступность генетического материала ограничена.

ВВЕДЕНИЕ

Определение размера ДНК — один из самых фундаментальных методов молекулярной биологии.Его обычно проводят для оценки результатов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (1), анализа рестрикционных фрагментов (2) и оценки качества извлеченной геномной или плазмидной ДНК (3). Растущая полезность секвенирования следующего поколения (NGS), при котором распределение фрагментов ДНК по размеру строго контролируется, вызывает новый интерес к определению размеров еще меньших количеств ДНК (4).

Наиболее широко используемыми методами определения размеров образцов ДНК являются гель-электрофорез (5) и его современные последователи, такие как импульсное поле (6,7) и капиллярный гель-электрофорез (2,8–11).Особое значение для секвенирования ДНК имеет устройство для электрофореза в капиллярном геле на микрофлюидной основе, известное как 2100 Bioanalyzer, которое было коммерциализировано компанией Agilent. Этот инструмент широко используется для определения размера ДНК в протоколах подготовки библиотеки NGS и считается золотым стандартом при определении размеров небольших количеств ДНК (12–15). Все вышеперечисленные методы основаны на разделении популяции молекул ДНК на основе размера и считывании среднего распределения по размерам. Они обеспечивают довольно точные оценки длины и количества, при этом обычные установки ограничиваются количеством ДНК в нанограммах, а методы на основе капилляров чувствительны к масштабу пикограмм.

Другой подход к определению размеров — проточная цитометрия одиночных молекул (16–19). Он основан на окрашивании ДНК интеркалирующим красителем (9,10,20), пропускании отдельных молекул ДНК через ограниченное лазерное пятно и обнаружении их интенсивности флуоресценции, которая позже может быть преобразована в длину. Конверсия возможна благодаря тому, что степень окрашивания при интеркаляции пропорциональна длине молекулы ДНК (21,22). Несмотря на их чувствительность к отдельным молекулам, этим методам не хватает разрешения и пропускной способности, и они требуют сложных индивидуальных настроек и регулярных калибровок (16,23).

В качестве альтернативы, визуализация отдельных молекул с помощью флуоресцентной микроскопии позволяет визуализировать отдельные молекулы ДНК, иммобилизованные на предметном стекле микроскопа (11,24–27). Поскольку визуализация ДНК часто осуществляется путем обнаружения флуоресценции интеркалирующего красителя, она, в принципе, должна позволять определять размер этих молекул на основе их интенсивности на изображении (28,29). На практике, поскольку окрашивание ДНК зависит от точных условий эксперимента и соотношения ДНК и красителя, очень сложно установить постоянный и точный коэффициент преобразования интенсивности в длину (30,31).Более того, ранее сообщалось, что условия окрашивания влияют на однородность образца, что приводит к плохому разделению и, как следствие, к низкой точности и разрешению измерений (32).

В этой работе мы используем визуализацию одиночных молекул с калибровкой размера in situ для точного анализа размера и массового распределения данного образца. Мы используем синтетические эталоны ДНК в качестве калибратора внутреннего размера. Ссылка состоит из двух различных популяций ДНК, которые синтезированы и ковалентно помечены Cy5 с помощью ПЦР (см. Дополнительную информацию).Добавление в исследуемый образец эталонного стандарта и окрашивание обоих вместе с интеркалирующим красителем нивелирует фактор переменных условий маркировки. Более того, чтобы иметь возможность определять размер образцов с неизвестной концентрацией, мы скорректировали условия мечения так, чтобы гомогенное окрашивание достигалось при чрезмерном соотношении мечения краситель: п.о. После визуализации мечение Cy5 референсных молекул ДНК позволяет их отделить от исследуемого образца во время анализа данных.Интенсивности эталонных молекул используются для создания калибровочной кривой для преобразования интенсивности в длину, которая позволяет определить размер неизвестного образца ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез ДНК

Все стандарты ДНК были синтезированы с помощью ПЦР с использованием набора Eppendorf Mastercycler proS и Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) с предоставленным буфером для ГХ. Продукты очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) с настроенным протоколом.Для получения подробных протоколов реакций ПЦР, условий термоциклирования, последовательностей праймеров и модификаций процедуры очистки см. Дополнительную информацию.

Мечение ДНК интеркалирующим красителем YOYO-1

Раствор, содержащий 1 нг ДНК, суспендированной в буфере ТЕ (10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,5), метили интеркалирующим красителем YOYO-1 при соотношении краситель: п.о. 1: 1 (92,5 нМ в 16 мкл). и инкубировали в течение ночи при 50 ° C. Перед визуализацией добавляли DTT до конечной концентрации 0,2 М, чтобы защитить краситель от фотообесцвечивания.

Осаждение интеркалированных образцов ДНК для визуализации

Для нанесения образца на поверхность контакта между положительно активированным покровным стеклом и необработанным предметным стеклом наносили 8 мкл образца, содержащего 400 пг ДНК. Жидкость втягивалась между поверхностями под действием капиллярных сил, и молекулы ДНК откладывались на положительной поверхности покровного стекла. Активацию покровных стекол осуществляют путем их инкубации в течение ночи со смесью азотной и соляной кислот (200 мл и 100 мл соответственно).После кислотной инкубации покровные стекла промывают деионизированной водой и техническим (96%) этанолом, сушат продувкой азотом и инкубируют в течение ночи при 65 ° C в смеси, содержащей 600 мкл N-триметоксисилилпропил-N, N, N-триметиламмонийхлорида, 50 % в метаноле и 200 мкл винилтриметоксисилана в 300 мл деионизированной воды. После силанизации покровные стекла промывали деионизированной водой и техническим этанолом и хранили в техническом этаноле при 4 ° C.

Визуализация образцов ДНК, сбор данных и анализ изображений

Иммобилизованные молекулы ДНК отображали на эпифлуоресцентном микроскопе (Till photonics, More), оборудованном камерой EMCCD с высоким разрешением (Andor IXon888). Для возбуждения использовалась ксеноновая лампа мощностью 150 Вт с набором фильтров 485 / 20ex и 525 / 30em (Semrock) для канала YOYO-1 и набором фильтров 650 / 13ex и 684 / 24em (Semrock) для канала Cy5. Сбор данных по нескольким полям обзора осуществлялся автоматически с использованием моторизованного столика и функции автофокусировки, основанной на отражении инфракрасного излучения от поверхности образца. Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения, разработанного специально для этого приложения, в результате чего была получена статистика от десятков до сотен тысяч молекул на образец.Программа обнаруживает отдельные молекулы ДНК и извлекает их интенсивности после локального вычитания фона, чтобы учесть неравномерное освещение поля зрения (см. Вспомогательную информацию на рис. S1, рис. S2 и рис. S3).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для подтверждения линейной зависимости интенсивности интеркаляции от длины ДНК, 1 нг лестницы ДНК размером 1 т. п.н. (NEB) метили интеркалирующим красителем YOYO-1 и отображали. Гистограмма, изображающая распределение интенсивности молекул в этом образце лестницы ДНК, показана на (рис. 1A).

Рис. 1.

Распределение интенсивности одной молекулы лестницы ДНК размером 1 т.п.н. ( A ) Гистограмма распределения интенсивности обнаруженных молекул (красный цвет), сумма подгонки Гаусса (черный цвет) и остаток подбора (синий цвет). ( B ) график ожидаемых длин ДНК в лестничном образце относительно центров подобранных гауссовых пиков демонстрирует линейную зависимость с R ² = 0,99932.

Рис. 1.

Распределение интенсивности одной молекулы лестницы ДНК размером 1 т.п.н.( A ) Гистограмма распределения интенсивности обнаруженных молекул (красный цвет), сумма подгонки Гаусса (черный цвет) и остаток подбора (синий цвет). ( B ) график ожидаемых длин ДНК в лестничном образце относительно центров подобранных гауссовых пиков демонстрирует линейную зависимость с R ² = 0,99932.

Полученное распределение содержит 10 пиков, соответствующих 10 популяциям ДНК в образце. Данные были подогнаны к 10 функциям Гаусса (см. Вспомогательную информацию), и ожидаемые длины популяций ДНК были нанесены на график относительно центров подобранных пиков (рисунок 1B).Линейная аппроксимация этого графика подтверждает линейную корреляцию между отображаемой интенсивностью и ожидаемой молекулярной длиной различных фрагментов в лестнице ДНК, соответствующей предыдущим наблюдениям (16).

Чтобы оценить динамический диапазон такой схемы обнаружения, мы также проверили, возможно ли обнаруживать образцы, содержащие более короткие фрагменты ДНК, и подтвердили, что фрагменты размером до 100 п.н. все еще могут быть разделены с высоким разрешением (см. Вспомогательную информацию на рис. S3 и Рисунок S4).

Затем, чтобы облегчить количественное определение размера неизвестного образца, был использован внутренний калибровочный стандарт размера. Этот эталонный стандарт представляет собой образец ДНК, содержащий фрагменты двух известных длин, ковалентно меченные множеством молекул флуоресцентного красителя Cy5. Два эталонных стандарта размером 2991 п.о. и 7029 п.н. (обозначаемые как популяции 3 т.п.н. и 7 т.п.н. соответственно) были синтезированы с помощью ПЦР. Два калибровочных стандарта были визуализированы, чтобы проверить отсутствие неспецифических продуктов ПЦР и убедиться, что все стандартные молекулы помечены Cy5 (см. Вспомогательную информацию на рисунках S5 и S6).Затем мы откалибровали эталонные стандарты, чтобы учесть изменения интенсивности, вызванные тушением флуоресценции YOYO-1 молекулами Cy5 (33). Это было сделано путем сравнения распределения интенсивности между стандартами, меченными Cy5, и немечеными продуктами ПЦР одинаковой длины. Образцы были помечены YOYO-1 и отображены в двух каналах (YOYO-1 и Cy5). Необработанная композиция двух изображений представлена ​​на рисунке 2A, где канал YOYO-1 имеет зеленый цвет, а канал Cy5 — красный.

Рисунок 2.

Анализ и калибровка меченого эталонного образца ДНК. ( A ) репрезентативное необработанное флуоресцентное изображение одного поля зрения (FOV) из двухцветного образца. Канал YOYO-1 зеленый, а канал Cy5 красный. ( B ) увеличенная часть поля зрения до (вверху) и после анализа изображения (внизу). Совместно локализованные молекулы классифицируются как эталоны, а остальные — как образцы. ( C ) типичная гистограмма интенсивностей молекул, обнаруженных в калибровочном образце. Серые данные представляют собой интенсивности немеченых молекул, а красные данные представляют интенсивности меченых.

Рисунок 2.

Анализ и калибровка меченого эталонного образца ДНК. ( A ) репрезентативное необработанное флуоресцентное изображение одного поля зрения (FOV) из двухцветного образца. Канал YOYO-1 зеленый, а канал Cy5 красный. ( B ) увеличенная часть поля зрения до (вверху) и после анализа изображения (внизу). Совместно локализованные молекулы классифицируются как эталоны, а остальные — как образцы. ( C ) типичная гистограмма интенсивностей молекул, обнаруженных в калибровочном образце. Серые данные представляют собой интенсивности немеченых молекул, а красные данные представляют интенсивности меченых.

Программа, используемая для анализа данных, определяет местонахождение молекул в обоих каналах и обнаруживает меченые эталонные молекулы на основе их перекрытия положения в двух цветовых каналах (рис. 2В). Совместно локализованные молекулы классифицируются как эталонные, а остальные считаются молекулами образцов, в результате чего образуются две популяции. Интенсивности обнаруженных молекул представлены в виде гистограммы, показывающей популяции размером 3 т.п.н. и 7 т.п.н., при этом серые данные представляют немеченые молекулы, а красные данные — эталонные стандарты, меченные Cy5, как показано на рисунке 2C.Несмотря на одинаковую длину, интенсивность флуоресценции эталонных стандартов Cy5 слабее, чем у немеченых молекул такой же длины, скорее всего, из-за передачи энергии от YOYO-1 к Cy5 (33). Тем не менее, это сравнение обеспечивает эффективную кажущуюся длину эталонных стандартов, называемую «отображаемой длиной». Подгонка серых данных к двум функциям Гаусса и построение теоретической длины продуктов ПЦР как функции подогнанных центров позволяет построить калибровочную кривую (см. Вспомогательную информацию на рисунке S7).Подгонка красных данных к двум функциям Гаусса и размещение их центров на калибровочной кривой дает отображаемую длину помеченных эталонных популяций. Отображаемые длины 2721 ± 106 п.н. и 6456 ± 82 п.н. были измерены соответственно для наших контрольных образцов путем усреднения результатов для нескольких образцов. Отметим, что этот эффект, скорее всего, можно минимизировать, используя молекулы красителя со смещенным синим излучением относительно интеркалирующего красителя.

Для моделирования анализа неизвестного образца 0.5 нг лестницы ДНК 1 т.п.н. (NEB) смешивали с 0,5 нг эталонного образца, содержащего предварительно откалиброванные популяции размером 3 т.п.н. и 7 т.п.н. Образец был помечен YOYO-1 и отображен в двух каналах. После автоматического анализа и классификации отображаемых данных была построена гистограмма интенсивностей образцов и эталонных молекул (рис. 3А).

Рисунок 3.

Распределение интенсивности молекул и калибровочная кривая. ( A ) гистограмма интенсивностей молекул.Серые данные представляют собой интенсивности молекул образца, а красные данные представляют собой интенсивности контрольных молекул. ( B ) Красные кружки представляют две калибровочные точки и соответствующую линейную аппроксимацию для преобразования интенсивности молекулы в длину в парах оснований. Черные отметки — это ожидаемая длина лестницы в зависимости от подобранной интенсивности популяций лестницы. Экспериментальные данные хорошо представлены калибровочной кривой.

Рисунок 3.

Распределение интенсивности молекул и калибровочная кривая.( A ) гистограмма интенсивностей молекул. Серые данные представляют собой интенсивности молекул образца, а красные данные представляют собой интенсивности контрольных молекул. ( B ) Красные кружки представляют две калибровочные точки и соответствующую линейную аппроксимацию для преобразования интенсивности молекулы в длину в парах оснований. Черные отметки — это ожидаемая длина лестницы в зависимости от подобранной интенсивности популяций лестницы. Экспериментальные данные хорошо представлены калибровочной кривой.

Эталонные данные были подогнаны с помощью двух функций Гаусса, и калибровочная кривая была построена с использованием центров подобранных пиков и результатов предыдущей калибровки (Рисунок 3B). Линейное уравнение использовалось для преобразования интенсивностей молекул образца в пары оснований, и была построена гистограмма длин молекул. Данные бункера гистограммы и молекулярной массы ДНК были использованы для преобразования количества гистограмм в количество ДНК в фемтограммах (рис. 4A).

Рисунок 4.

Результаты экспериментов. ( A ) гистограмма и подобранная гауссианская сумма обнаруженных количеств ДНК в зависимости от рассчитанной длины ДНК. Серым цветом показаны экспериментальные данные, черная кривая представляет собой подобранную сумму Гауссианы, а синяя — невязку аппроксимации. Вставка представляет собой лестницу ДНК, как видно в стандартной установке для гель-электрофореза. ( B ) график нормализованных относительных количеств 10 популяций в выборке. Черный — это ожидаемое распределение в соответствии со спецификациями лестничной диаграммы ДНК, зеленый — это экспериментальное распределение, а красные данные — это результаты высокочувствительного анализа системы микрофлюидного капиллярного гель-электрофореза Bioanalyzer.

Рисунок 4.

Результаты экспериментов. ( A ) гистограмма и подобранная гауссианская сумма обнаруженных количеств ДНК в зависимости от рассчитанной длины ДНК. Серым цветом показаны экспериментальные данные, черная кривая представляет собой подобранную сумму Гауссианы, а синяя — невязку аппроксимации. Вставка представляет собой лестницу ДНК, как видно в стандартной установке для гель-электрофореза. ( B ) график нормализованных относительных количеств 10 популяций в выборке. Черный — это ожидаемое распределение в соответствии со спецификациями лестничной диаграммы ДНК, зеленый — это экспериментальное распределение, а красные данные — это результаты высокочувствительного анализа системы микрофлюидного капиллярного гель-электрофореза Bioanalyzer.

Всего в этом эксперименте было отобрано 250 фг исследуемой ДНК, и распределение длины в зависимости от количества было подогнано к 10 функциям Гаусса, где центр каждого пика — длина популяции, а его площадь — количество ДНК для каждого Население. Центры пиков обнаруженного распределения близко соответствуют ожидаемому распределению длин (см. Вспомогательную информационную таблицу S1). Фактически, распределение по размерам восстанавливается, даже когда отобранная часть набора данных сокращается до примерно 10 фг ДНК (см. Рисунки S8 – S10 во вспомогательной информации).

Мы отмечаем, что распределения демонстрируют монотонное расширение подобранных гауссианов с увеличением длины ДНК (рисунок S11 в вспомогательной информации). Однако при вычислении относительной ошибки оценки (% ошибки) мы обнаруживаем, что ошибка уменьшается с увеличением длины ДНК, что соответствует ранее опубликованным результатам (16) (рисунок S12 в вспомогательной информации). Хотя метод двухточечной калибровки, используемый в нашем анализе, дает хорошие оценки размера и его практически легче выполнять, мы проверили, может ли использование дополнительных точек калибровки значительно улучшить результаты. Набор данных был повторно проанализирован, взяв некоторые из лестничных популяций в качестве эталона и построив калибровочные кривые по трем и четырем точкам (см. Вспомогательную информацию на рисунке S13). Результаты показывают, что средняя ошибка оценки анализа остается практически неизменной (как для длины, так и для относительного нормализованного количества), что указывает на то, что калибровка по двум точкам при точном выполнении представляет собой хороший компромисс между производительностью и простотой использования (см. Информационная таблица S1 и таблица S2).

Чтобы протестировать наш анализ одиночных молекул, мы сравнили наши результаты с результатами, полученными с помощью микрожидкостного гель-электрофореза, метода, который считается современным для таких приложений. На рисунке 4B ожидаемые нормализованные относительные количества популяций в выборке представлены черным цветом, а наши экспериментальные результаты — зеленым. Красные данные представляют результаты, полученные для 100 пг ДНК с использованием высокочувствительного анализа прибора Bioanalyzer (Agilent Technologies). Мы также прогнали образцы 500 мкг и 1000 мкг на Bionalyzer, чтобы проверить его возможности определения размеров для больших количеств ДНК. Измеренная длина и относительное нормализованное количество каждой популяции для всех экспериментов суммированы в таблицах S3 и S4 вспомогательной информации. Интересно отметить, что Биоанализатор обнаружил только 9 из 10 популяций для образца 100 пг (отсутствует популяция 4 kbp). Фактически, он также пропустил ту же самую популяцию для выборки 500 мкг и смог разрешить ее только для наиболее концентрированной выборки 1000 мкг.

Мы рассчитали, что средняя ошибка оценки общей длины для нашего анализа составляет 3,5%, тогда как ошибка Биоанализатора почти вдвое больше для образца 100 пг и увеличивается с увеличением концентрации образца (см. Вспомогательную информационную таблицу S3). Напротив, биоанализатор был более точным в представлении относительных количеств ДНК в каждой популяции (см. Вспомогательную информационную таблицу S4). Мы полагаем, что эта ошибка оценки возникает из-за неоднородного распределения молекул на покровном стекле и того факта, что в нашем анализе отбирается только часть всего образца, в отличие от биоанализатора, который анализирует образец в целом. Дальнейшие разработки, которые позволят ограничить выборку визуализируемой областью, должны преодолеть это ограничение.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этой работе мы представили подход с использованием одной молекулы для количественной оценки длины и распределения количества образца ДНК. Добавление эталона к исследуемому образцу перед окрашиванием нивелирует вариации условий маркировки между образцами, тогда как одновременная визуализация отменяет параметры сбора и вариации поверхности для визуализации.Результатом является надежный и воспроизводимый анализ, который не зависит от точных условий маркировки и метода сбора данных. Коэффициенты мечения, примененные в этой работе, показывают, что гомогенная интеркаляция может быть достигнута даже при чрезмерном мечении (соотношение краситель: п.о. 1: 1), что противоречит предыдущим предположениям (32) и позволяет применять этот анализ к образцам с неизвестной концентрацией. Мы продемонстрировали способность воспроизводить распределение по размерам сложного образца ДНК путем визуализации и анализа небольшой части образца до небольших фемтограмм. Эти низкие количества ДНК соответствуют нескольким процентам от общего содержания геномной ДНК в одной клетке. Наши результаты представляют собой значительное улучшение существующих методов определения размеров ДНК и могут найти полезные приложения для генетического анализа, где точное распределение молекул ДНК по размерам имеет решающее значение. Примеры включают определение характеристик свободно циркулирующей ДНК в плазме или моче (34–36), анализ теломер (37–45) и митохондриальной ДНК (46,47) или в сочетании с подготовкой библиотеки для секвенирования.Явным преимуществом одномолекулярного подхода является то, что он позволяет изучать образцы, где доступность генетического материала ограничена, например, в медицинских микробиопсиях (48,49) или циркулирующих опухолевых клетках, выделенных из плазмы (49,50). Мы надеемся, что высокая совместимость этого анализа с автоматизацией и распараллеливанием позволит обрабатывать и анализировать несколько образцов и может стать высокопроизводительной платформой для анализа ДНК.

Ю.Э. выражает признательность за финансирование программы i-Core Израильского научного фонда, Фонда карьерной интеграции Марии Кюри и Европейского исследовательского совета.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

программа i-Core Израильского научного фонда [1902/12]; Мария Кюри Карьерная интеграция и начало работы Европейского исследовательского совета [337830]. Финансирование платы за открытый доступ: программа i-Core Израильского научного фонда [1902/12], грант Марии Кюри на карьерную интеграцию и начало работы Европейского исследовательского совета [337830].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Интегрированная система для быстрого анализа ДНК на основе ПЦР в микрофлюидных устройствах

Анал.Chem.

2000

72

2995

3000

2.

Интегрированное микроустройство для анализа рестрикционных фрагментов ДНК

Анал. Chem.

1996

68

720

723

3.

Саузерн-блот-анализ ДНК, выделенной из фиксированных формалином патологических образцов

Cancer Res.

1986

46

2964

2969

4.

Новые достижения в библиотеке NGS Prep QC

Genet. Англ. Biotechnol. Новости

2015

35

22

23

5.

Обнаружение специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом

J. Mol. Биол.

1975

98

503

517

6.

Гель-электрофорез в импульсном поле

Анал.Chem.

1991

63

658

665

7.

Гель-электрофорез в импульсном поле

Нац. Protoc.

2007

2

677

684

8.

Точное определение размера фрагментов ДНК с помощью капиллярного электрофореза с использованием массива лазерно-индуцированной флуоресценции для определения специфичности последовательности повреждений ДНК

Анал.Chem.

2008

80

2212

2221

9.

Использование флуоресцентных интеркалирующих красителей POPO-3, YOYO-3 и YOYO-1 для сверхчувствительного обнаружения двухцепочечной ДНК, разделенной капиллярным электрофорезом с гидроксипропилметилцеллюлозой и несшитым полиакриламидом

J. Chromatogr. A

1994

669

205

216

10.

Сверхчувствительное обнаружение генетически модифицированной ДНК кукурузы с помощью капиллярного гель-электрофореза с лазерно-индуцированной флуоресценцией с использованием различных флуоресцентных интеркалирующих красителей

J. Agric. Food Chem.

2002

50

4497 ​​

4502

11.

Микрожидкостный анализ реплицирующихся молекул ДНК

Нац. Protoc.

2009

4

849

861

12.

Оценка размера и количественного определения фрагментов ДНК с помощью биоанализатора Agilent 2100

Clin. Chem.

2000

46

1851

1853

13.

Микрофабричный биоанализатор для электрофореза капиллярной решетки с 384 дорожками для сверхвысокопроизводительного генетического анализа

Анал. Chem.

2002

74

5076

5083

14.

Деградированная ДНК может вызывать несоответствие статуса KRAS между первичным колоректальным раком и соответствующими метастазами в печени

Внутр. J. Clin. Онкол.

2014

19

113

120

15.

и другие.

Молекулярная диагностика на основе размеров с использованием ДНК плазмы для неинвазивного пренатального тестирования

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2014

111

8583

8588

16.

Микроустройство для определения размера и сортировки молекул ДНК

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1999

96

11

13

17.

Быстрое определение размера отдельных флуоресцентно окрашенных фрагментов ДНК с помощью проточной цитометрии

Nucleic Acids Res.

1993

21

803

806

18.

Определение размера больших фрагментов ДНК с помощью проточной цитометрии: применение для характеристики клонов искусственной хромосомы P1 (PAC)

Nucleic Acids Res.

1996

24

4202

4209

19.

Разработка протокола окрашивания ДНК на основе механизма с использованием окрашивания нуклеиновой кислоты SYTOX оранжевым и проточной цитометрии для определения размера фрагментов

Анал. Biochem.

2000

286

138

148

20.

Стабильные комплексы интеркаляции краситель-ДНК в качестве реагентов для высокочувствительного флуоресцентного детектирования

Природа

1992

359

859

861

21.

Стабильные флуоресцентные комплексы двухцепочечной ДНК с бисинтеркалирующими асимметричными цианиновыми красителями: свойства и применение

Nucleic Acids Res.

1992

20

2803

2812

22.

Стабильный двухцепочечный гомодимерный комплекс ДНК-этидий: применение для пикограммной флуоресцентной детекции ДНК в агарозных гелях

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1990

87

3851

3855

23.

Обнаружение флуоресценции и измерение размера отдельных молекул ДНК

Анал. Chem.

1993

65

849

852

24.

и другие.

Визуализация и определение размеров отдельных молекул ДНК на мобильном телефоне

САУ Нано

2014

8

12725

12733

25.

Оптическое обнаружение эпигенетических меток: точная количественная оценка и прямая визуализация индивидуальных оснований гидроксиметилцитозина

Chem. Commun.

2013

49

8599

8601

26.

Освещение отдельных участков повреждения ДНК с помощью синтеза репарации in vitro

J. Am. Chem. Soc.

2014

136

7771

7776

27.

Простой метод растяжения ДНК для флуоресцентной визуализации отдельных молекул ДНК

Nucleic Acids Res.

2006

34

e113

28.

и другие.

Автоматическое оптическое картирование высокого разрешения с использованием упорядоченных, фиксированных в жидкости молекул ДНК

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1998

95

8046

8051

29.

и другие.

Микрожидкостная система для больших массивов молекул ДНК

Анал.Chem.

2004

76

5293

5301

30.

Характеристика связывания флуоресцентных красителей YO и YOYO с ДНК с помощью спектроскопии в поляризованном свете

J. Am. Chem. Soc.

1994

116

8459

8465

31.

Механические и структурные свойства комплексной ДНК YOYO-1

Nucleic Acids Res.

2010

38

6526

6532

32.

Двойные полосы в гель-электрофорезе ДНК, вызванные бисинтеркалирующими красителями

Nucleic Acids Res.

1995

23

2413

2420

33.

Система штрихового кодирования одной молекулы с использованием нанощелей для анализа ДНК

Proc. Natl. Акад.Sci. США

2007

104

2673

2678

34.

Разделение циркулирующей ДНК в плазме крови матери по размеру позволяет легко выявлять полиморфизмы ДНК плода

Clin. Chem.

2004

50

1002

1011

35.

Распределение ДНК матери и плода в плазме матери по размеру

Clin.Chem.

2004

50

88

92

36.

Фрагменты ДНК в плазме крови онкологических больных: количественное определение и доказательства их происхождения из апоптотических и некротических клеток

Cancer Res.

2001

61

1659

1665

37.

Различия в длине теломер между гомологичными хромосомами у людей

Nucleic Acids Res.

2001

29

3164

3171

38.

Новые разработки в области анализа длины теломер

Exp. Геронтол.

2005

40

363

368

39.

Самая короткая теломер, отличная от средней длины теломер, имеет решающее значение для жизнеспособности клетки и стабильности хромосом

Ячейка

2001

107

67

77

40.

Двухступенчатая модель старения, запускаемого одним критически коротким теломером

Нац. Cell Biol.

2009

11

988

993

41.

Измерение длины теломер с помощью цифровой флуоресцентной микроскопии

Цитометрия

1999

36

267

278

42.

Измерение теломер методом количественной ПЦР

Nucleic Acids Res.

2002

30

e47

43.

Метод количественной ПЦР для измерения абсолютной длины теломер

Biol. Процедуры. Онлайн

2011

13

3

44.

Измерение длины теломер с помощью саузерн-блоттинга длин концевых рестрикционных фрагментов

Нац. Protoc.

2010

5

1596

1607

45.

Предупреждения об измерении длины теломер и критическая оценка доступных технологий и инструментов

Mutat. Res.

2012

730

59

67

46. ​​

Изменения числа копий митохондриальной ДНК и длины теломер с ранними невзгодами и психопатологией

Biol. Психиатрия

2015

47.

и другие.

Прогрессирование заболевания у пациентов с единичными крупномасштабными делециями митохондриальной ДНК

Мозг

2014

137

323

334

48.

Жидкая биопсия: генотипирование циркулирующей ДНК опухоли

J. Clin. Онкол.

2014

32

579

586

49.

Циркулирующая ДНК опухолевого происхождения короче соматической ДНК в плазме

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2015

112

3178

3179

50.

Изоляция циркулирующих опухолевых клеток: марафон, который стоит пробежать

Clin. Chem.

2014

60

287

289

© Автор (ы) 2015.Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

Европа PMC

Десятки тысяч повреждений ДНК ежедневно образуются в живых организмах в результате экзогенного и эндогенного воздействия ¹ .Геномная нестабильность играет инициирующую роль в канцерогенезе ^2,3 , участвует в старении ^4–6 и связана с болезнью Альцгеймера ^7–9 и другими заболеваниями. Повреждение ДНК принимает форму двух- или одноцепочечных разрывов и различных химических модификаций самих оснований ^10,11 . Учитывая важность повреждения ДНК и его роль в нестабильности генома, необходимы надежные экспериментальные методы для измерения и количественной оценки повреждений ДНК.

Одно- и двухцепочечные разрывы обычно измеряются косвенно с помощью маркеров разрыва цепей, таких как фосфо-h3AX (γh3AX) или 53BP-1, и количественно оцениваются с помощью иммунофлуоресценции или иммуноферментного анализа (ELISA) ^12,13 .Кометный анализ или одноклеточный гель-электрофорез позволяет более специфично определять разрыв цепи в клетках, устраняя потребность в специфических антителах ¹⁴ . Обнаружение химических модификаций представляет собой еще более сложную задачу из-за их разнообразия. Двумя основными типами поврежденных базовых модификаций являются окислительные ¹⁵ и фотопродукты ¹⁶ . Окислительные основные повреждения являются продуктами реакции активных форм кислорода (АФК) и азотистых оснований ¹⁷ . Было идентифицировано более 20 различных модификаций окислительного основания с 8-оксо-2’дезоксигуанозином (8-oxodG) в качестве примечательного примера ¹⁵ . Фотопродукты представляют собой сшивки между соседними пиримидиновыми основаниями, , т.е. , димерами циклобутан-пиримидина (ЦПД) или (6–4) пиримидин-пиримидоновыми структурами, которые возникают в результате прямого воздействия ультрафиолетового (УФ) излучения ^18,19 . Химические модификации могут также происходить в смесях, когда УФ-излучение производит АФК, которые вызывают окислительное повреждение оснований в дополнение к фотопродуктам ^20,21 .Прямая количественная оценка этих типов повреждений или их комбинаций ограничена из-за необходимости в антителах, специфичных для каждого типа поражения.

Недавние разработки подходов с использованием отдельных молекул продемонстрировали, что различные повреждения оснований ДНК можно охарактеризовать с помощью анализа отдельных молекул ДНК ^22–25 . Используя коммерческий коктейль ферментов репарации, мы ранее проанализировали глобальное количество повреждений ДНК и динамику репарации в линиях клеток человека ²⁶ . Хотя этот подход показал очень высокую чувствительность, он не смог различить различные типы повреждений из-за использования смеси ферментов репарации, распознающих различные типы повреждений.Чтобы удовлетворить потребность в одновременном обнаружении нескольких конкретных типов повреждений, мы разработали анализ для одновременного обнаружения многоцветных одиночных молекул и относительного количественного определения фотопродуктов и продуктов окисления.

Чтобы облегчить различение типов повреждений посредством маркировки разными цветами, мы сначала использовали две отдельные реакции для маркировки окислительного повреждения и фотопродуктов. В качестве модели фотопродуктов мы использовали клетки HEK, подвергшиеся воздействию УФА, УФВ или УФС-излучения в течение увеличивающихся периодов времени, что привело к увеличению дозы УФ-излучения. Окислительное повреждение было вызвано воздействием на клетки НЕК увеличивающихся концентраций перекиси водорода. Мечение фотопродуктов проводили с помощью пиримидиндимергликозилазы (T4 PDG), фермента, который распознает цис-син-циклобутановые димеры пиримидина, вызванные УФ-облучением ²⁷ . Окислительное повреждение было специально помечено с использованием человеческой 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (hOGG1), фермента, высвобождающего поврежденные пурины из двухцепочечной ДНК ²⁸ . Для каждого эксперимента контрольный образец ДНК, экстрагированный из необработанных клеток, служил для оценки исходного уровня эндогенного повреждения ДНК.Мы сравнили результаты наших анализов с коммерческим коктейлем репарационных ферментов (смесь PreCR), чтобы проверить их корреляцию. После маркировки участков повреждения и без дополнительной очистки основу ДНК окрашивали, а затем растягивали на модифицированных предметных стеклах для визуализации. Данные были проанализированы с использованием специального программного обеспечения, которое обнаруживает растянутые молекулы ДНК и подсчитывает количество меток вдоль контура ДНК, сообщая о количестве участков повреждения как функции общей измеренной длины ДНК ²⁹ (для расчетов ошибок см. Рис.S1, а подробные сведения об эксперименте см. В разделе методов, ESI †).

Как и ожидалось, большее количество повреждений ДНК было вызвано более длительным облучением или более высокой концентрацией перекиси водорода в соответствии с результатами, полученными с использованием смеси PreCR (рис. S2 и рис. S3, ESI †). Мы также наблюдали повышенный уровень повреждения при использовании более коротких волн и более высокой энергии УФ-излучения. При обработке ДНК, выделенной из облученных клеток смесью hOGG1, наблюдали флуоресцентное мечение, что указывает на то, что облучение индуцировало окислительное повреждение ДНК в дополнение к фотопродуктам.Оба типа повреждений увеличивались с УФС дозозависимым образом (см. Рис. S2a, ESI †). УФ-В излучение показало лишь небольшое увеличение фотопродуктов без увеличения окислительного повреждения (см. Рис. S2b, ESI †). Излучение UVA не вызывало заметного увеличения любого из типов повреждений, измеренных в диапазоне доз (см. Рис. S2c, ESI †).

Мы обнаружили, что результаты наших анализов мечения более воспроизводимы, чем результаты, полученные с использованием смеси PreCR (см. Рис. S4, ESI †). В оптимизированные реакции было добавлено несколько улучшений.Во-первых, мы обнаружили, что hOGG1 работает лучше, чем фермент формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg), присутствующий в коммерческой смеси PreCR, для восстановления окислительного повреждения. Fpg производил значительное количество неспецифической маркировки, которая препятствовала количественному анализу (см. Рис. S5, ESI †). Кроме того, в оптимизированных реакциях мы использовали полимеразу с большим фрагментом Bst вместо полного фрагмента Bst. Большой фрагмент Bst вызывал значительно меньшее неспецифическое мечение концов молекул ДНК и, таким образом, лучше подходил для количественной оценки повреждений (см.рис.S6, ESI †). Важно отметить, что мы обнаружили, что реакция для фотопродуктов вызывает мечение в клетках, обработанных перекисью водорода, где фотопродукты не ожидаются (см. Рис. S3, ESI †). Это связано с присутствием эндонуклеазы IV, которая используется для кондиционирования промежутков, но также известно, что она обнаруживает и устраняет окислительное повреждение и AP-сайты. Однако удаление эндонуклеазы IV из этой реакции резко снижает эффективность мечения теста, подчеркивая его важность (см.рис.S7, ESI †).

Учитывая, что УФ-излучение приводит к смешанным модификациям оснований на одних и тех же молекулах ДНК, одновременное количественное определение как окислительных повреждений, так и фотопродуктов позволит по-новому взглянуть на механизмы повреждения ДНК и динамику их восстановления. Спектрально разные флуоресцентные метки дают возможность назначать разные цвета разным типам повреждений в одном образце и на одной и той же молекуле ДНК. Чтобы выделить несколько типов повреждений на одном и том же образце, мы последовательно выполнили две специфические для повреждений реакции, ферментативно разрушая флуоресцентные нуклеотиды между реакциями мечения (подробности эксперимента см. В разделе, посвященном методам, ESI †).Сначала мы обозначили окислительное повреждение одним цветом, используя смесь hOGG1, а затем фотопродукты вторым цветом. Для селективного мечения каждого типа повреждения отдельным флуоресцентным нуклеотидом мы использовали термочувствительную фосфатазу для отщепления фосфатных групп от любых остаточных флуоресцентных нуклеотидов из первой реакции, оставляя концевую гидроксильную группу, которая предотвращает дальнейшее включение ДНК-полимеразой. Затем наносится вторая смесь ферментов вместе со спектрально различными нуклеотидами, которые вставляются ДНК-полимеразой на втором этапе репарации.Таким образом, количество флуоресцентных меток каждого цвета отражает количество повреждений ДНК каждого типа. представляет различные стадии реакции множественного мечения.

Схематическое изображение реакции множественного мечения, которая выделяет несколько типов повреждений в одном и том же образце ДНК. Сначала восстанавливается окислительное повреждение ДНК с использованием ферментов hOGG1 и эндонуклеазы IV с последующей маркировкой красителем ATTO550 (обозначено синими маркерами). Затем нуклеотиды ATTO550 становятся неактивными под действием щелочной фосфатазы, которая удаляет фосфатные группы из невключенных нуклеотидов с последующей тепловой инактивацией.Наконец, фотопродукты восстанавливаются с использованием ферментов T4 PDG и эндонуклеазы IV с последующей маркировкой красителем ATTO647N (обозначено красными маркерами).

Чтобы проверить нашу реакцию множественного мечения, мы использовали ранее проанализированные клетки HEK, подвергшиеся воздействию УФ-излучения, поскольку эти образцы показали увеличение как окислительного повреждения, так и фотопродуктов. показаны некоторые репрезентативные меченые молекулы ДНК из визуализированных данных и результатов анализа изображений. был вырезан из типичного поля зрения (см. рис. S8, ESI †), содержащего меченые молекулы ДНК из отображаемых данных.Каждая серая структура представляет собой молекулу ДНК, а красные точки представляют собой восстановленные участки фотопродуктов, а синие точки представляют восстановленные участки окислительного повреждения. показывает молекулы ДНК, обнаруженные программным обеспечением для анализа изображений (зеленый), а также обнаруженные участки окисления (синий) и участки фотопродуктов (красный). Анализируются только линейные молекулы с минимальной длиной 12 т.п.н., которые не пересекают другие молекулы. показывает увеличение как фотопродуктов, так и окислительного повреждения с увеличением дозы УФ-излучения. Результаты для обоих типов повреждений получают одновременно из одного и того же образца и коррелируют с результатами, полученными для отдельных реакций (рис. S2c), хотя абсолютные числа меняются из-за различных условий реакции.Мы отмечаем, что из-за способности реакции мечения фотопродуктов также восстанавливать некоторые окислительные повреждения (см. Рис. S3, ESI †), важно сначала нанести смесь hOGG1, специфичную для окислительного повреждения, и только затем нанести фотопродукт T4. Смесь PDG (см. Рис. S9, ESI †).

Одновременное обнаружение и количественная оценка фотопродуктов и окислительного повреждения ДНК в клетках HEK, подвергшихся воздействию УФС-излучения. (а) Флуоресцентное изображение молекул ДНК, меченных с помощью реакции множественного мечения. Серый цвет представляет собой основу молекул ДНК, красные точки представляют участки фотопродуктов, а синие точки представляют участки окислительного повреждения.(б) Результаты анализа необработанного изображения с использованием автоматического программного обеспечения. Зеленый — обнаруженные молекулы ДНК, красные точки — обнаруженные метки фотопродуктов, синие точки — обнаруженные участки окислительного повреждения. (c) Дозовая реакция клеток НЕК, подвергшихся воздействию УФС-излучения, как определено с помощью реакции множественного мечения. Красный представляет уровни обнаруженных фотопродуктов, а синий — уровни окислительного повреждения.

UVC показывает наиболее сильную индукцию фотопродуктов и окислительных повреждений; тем не менее, он в основном поглощается атмосферным озоном и в меньшей степени влияет на воздействие на человека.Окружающий солнечный свет в УФ-диапазоне — это в основном УФ-А (90–95%) и остаточный УФ-В (5–10%). В то время как более длинные волны UVA проникают глубоко в дерму, UVB преимущественно поглощаются более поверхностными слоями эпидермиса кожи ³⁰ . Это основная причина солнечных ожогов и играет ключевую роль в развитии рака кожи ^31,32 . Поэтому, чтобы продемонстрировать применимость наших методов для изучения воздействия, мы исследовали клетки кожи человека, подвергшиеся воздействию «УФ-излучения окружающей среды» с центром в 315–320 нм, прямо на границе раздела между УФ-А и УФ-В светом.Мы использовали иммортализованные клетки кератиноцитов человека (HaCaT) и подвергли их воздействию этого излучения с плотностью мощности 1 Вт / м ² , пытаясь имитировать солнечное облучение на этой длине волны ^33–35 . Сначала мы исследовали дозовую реакцию клеток HaCaT на UVB, одновременно отслеживая возрастающие уровни как фотопродуктов, так и окислительного повреждения. Затем мы отслеживали процесс восстановления этих повреждений, возвращая клетки в инкубатор в течение заданных интервалов времени восстановления после облучения и измеряя сохранение фотопродуктов и окислительных повреждений в геномной ДНК после каждого заданного времени восстановления. Как и прежде, неэкспонированные клетки служили контролем для уровней базального повреждения в каждом эксперименте (подробности эксперимента см. В разделе, посвященном методам, ESI †). суммирует измерения повреждений для экспериментов с клетками HaCaT с использованием нашей двухцветной реакции.

«Экологическое УФ» -индуцированное повреждение и репарация ДНК в модельной клеточной линии кожи человека HaCaT, как обнаружено с помощью реакции множественного мечения. (а) Ответ клеток HaCaT на увеличивающуюся дозу УФ-В излучения. (b) Динамика восстановления за 180 минут в клетках HaCaT, подвергшихся воздействию 1800 Дж / м ² УФB-излучения.На обоих графиках красный цвет представляет уровни обнаруженных фотопродуктов, а синий — уровни окислительного повреждения.

показывает, что увеличенное время облучения приводит к более высоким уровням фотопродуктов (красный) и окислительному повреждению (синий), как и ожидалось. В, мы показываем динамику восстановления повреждений ДНК клеток HaCaT, подвергшихся воздействию 1800 Дж / м ² «УФ-излучения окружающей среды». Сразу после облучения наблюдается резкое увеличение уровней повреждений, а затем наблюдается постепенное снижение уровней повреждений в зависимости от времени восстановления из-за естественного процесса восстановления клеток.

Таким образом, мы продемонстрировали подход с использованием одной молекулы для отличительной маркировки двух основных типов повреждений ДНК для одновременного обнаружения. Во всех экспериментах для эффективной маркировки требовалось всего 50 нг ДНК, что является важным фактором в случае редких биологических образцов. Реакция множественного мечения не требует какой-либо очистки или удаления свободных флуоресцентных нуклеотидов перед визуализацией, что увеличивает выход и сокращает время подготовки. Автоматическая визуализация образцов и процесс анализа изображений значительно упростили всю процедуру, сделав весь анализ надежным и простым.Более того, новый протокол активации покровного стекла намного быстрее, что сокращает время анализа. Хотя это исследование было сосредоточено на фотопродуктах и ​​окислительном повреждении, этот метод не ограничивается этими типами повреждений. Эту методологию можно использовать с любым конкретным репаративным ферментом для обозначения других представляющих интерес типов повреждений и мониторинга динамики репарации. Подход также можно комбинировать с эпигенетическим маркированием, чтобы понять взаимосвязь между повреждением ДНК и эпигенетической модуляцией ^36–39 .Некоторые из наиболее интересных вопросов в этой области требуют знания местоположения конкретных повреждений в геноме. Геномное распределение повреждений ДНК потенциально может быть картировано с использованием технологии наноканалов и интеграции этого подхода к маркировке с оптическим картированием генома, как недавно было показано для метилирования ДНК ^40–43 . В целом, этот анализ легко адаптируется для различных биологических исследований и может быть легко расширен для получения дополнительной информации, при этом требуя минимальных знаний.

Глобальная модуляция эпигенетики ДНК во время активации провоспалительных макрофагов

dc.contributor.author

Джайн, Нихил

dc.contributor.author

Шахал, Тамар

dc.contributor.author

Габриэли, Цлиль

dc.contributor.author

Гилат, Ноа

dc.contributor.author

Торчинский, Дмитрий

dc.contributor.author

Михаэли, Яэль

постоянного тока.Contributor.author

Фогель, Альт

dc.contributor.author

Эбенштейн, Юваль

dc.date. Вступил в силу

2019-10-14T10: 21: 01Z

dc.date.available

2019-07-17T18: 37: 54Z

dc.date.available

2019-07-19T17: 28: 04Z

dc.date.available

2019-10-14T10: 21: 01Z

dc.date. Выдан

2019-07-08

dc.identifier.issn

1559-2294

постоянного тока.идентификатор.issn

1559-2308

dc.identifier.other

10.1080 / 15592294.2019.1638700

ru_US

dc.identifier.uri

http://hdl.handle.net/20.500.11850/353688

dc.publisher

Тейлор и Фрэнсис

ru_US

dc.subject

Активация макрофагов

ru_US

dc.subject

визуализация одиночных молекул

ru_US

постоянного тока.субъект

Метилирование ДНК

ru_US

dc.subject

Секвенирование РНК

ru_US

dc.subject

масс-спектроскопия

ru_US

dc. название

Глобальная модуляция эпигенетики ДНК во время активации провоспалительных макрофагов

ru_US

dc.date.published

2019-07-08

ethz.journal.title

Эпигенетика

этц.journal.volume

14

ru_US

ethz.journal.issue

12

ru_US

ethz.pages.start

1183

ru_US

ethz.pages.end

1193

ru_US

этц. Грант

Процессы механотрансдукции от периферии клетки к ядру в 2D и 3D микросредах

ru_US

ethz.publication.place

Абингдон

ru_US

этц.Publication.status

опубликовано

ru_US

ethz.leitzahl

ETH Zürich :: 00002 — ETH Zürich :: 00012 — Lehre und Forschung :: 00007 — Departemente :: 02070 — Dep. Gesundheitswiss. und Technologie / Dep. наук и технологий в области здравоохранения :: 02540 — Institut für Translationale Medizin / Институт трансляционной медицины :: 03640 — Vogel, Viola / Vogel, Viola

ethz.leitzahl.сертифицировано

ETH Zürich :: 00002 — ETH Zürich :: 00012 — Lehre und Forschung :: 00007 — Departemente :: 02070 — Dep.Gesundheitswiss. und Technologie / Dep. наук и технологий в области здравоохранения :: 02540 — Institut für Translationale Medizin / Институт трансляционной медицины :: 03640 — Vogel, Viola / Vogel, Viola

ethz.grant.agreementno

156931

ethz.grant.fundername

СНФ

ethz.grant.funderDoi

10.13039 / 501100001711

ethz.grant.программа

Interdisziplinäres Projekt

ethz.date.deposited

2019-07-17T18: 37: 57Z

этц.наличие

Только метаданные

ru_US

ethz.rosetta.installDate

2019-10-14T10: 21: 13Z

ethz.rosetta.lastОбновлено

2020-02-15T22: 02: 02Z

ethz.rosetta.version Экспортировано

правда

ethz.COinS

ctx_ver = Z39.88-2004 & amp; rft_val_fmt = info: ofi / fmt: kev: mtx: journal & amp; rft.atitle = Global% 20modulation% 20in% 20DNA% 20epigenetics% 20during% 20pro-воспалительный% 20macrophage% 20activation & amp; rft.jtitle = Epigenetics & amp; rft.date = 2019-07-08 & amp; rft.volume = 14 & amp; rft.issue = 12 & amp; rft.spage = 1183 & amp; rft.epage = 1193 & amp; rft.issn = 1559-2294 & amp; 1559-2308 & amp; rft.au = Джайн,% 20Nikhil & amp; Shahal,% 20Tamar & amp; Gabrieli,% 20Tslil & amp; Gilat,% 20Noa & amp; Torchinsky,% 20Dmitry & amp; rft.genre = article & amp; rft_id = amp; info: doi / 10.1080 / 15592294.2019

Голод может сократить продолжительность жизни мужчин и детей

Новое израильское исследование показывает, что тело сохраняет генетическую память о голоде и влияет на продолжительность жизни.Исследование, проведенное Тель-Авивским университетом, предполагает, что периоды голодания или голодания могут значительно сократить продолжительность жизни как детей, так и их потомков мужского пола.

Исследование было сосредоточено на людях, переживших массовый голод, случившийся в начале 1920-х годов в нескольких сельских регионах России.

«Различные экспериментальные и эпидемиологические исследования пытались предположить, что прерывистое или периодическое голодание, такое как ограничение калорийности, может замедлить процесс старения и продлить продолжительность жизни», — сказал проф.Евгений Кобылянский из Медицинской школы им. Саклера ТАУ. «Но есть также свидетельства того, что даже умеренное ограничение калорийности не может продлить, а, наоборот, может сократить продолжительность жизни человека».

Помимо Кобылянского, исследование проводилось докторантом Дмитрием Торчинским с факультета точных наук Раймонда и Беверли Саклер ТАУ в сотрудничестве с доктором Леонидом Каличманом с кафедры физиотерапии Университета Бен-Гуриона и профессором Давидом Карасиком из Бар-Илана. Медицинский факультет университета в Галилее.Его выводы были опубликованы в журнале The American Journal of Clinical Nutrition .

Исследовательская группа изучила теломеры — сложные структуры на конце каждой хромосомы, которые защищают конец хромосомы от разрушения и являются генетическим ключом к долголетию.

Предыдущие исследования показывают сильную корреляцию между динамикой теломер и процессами, которые определяют старение и продолжительность жизни человека. Они укорачиваются с каждым циклом репликации хромосом.

Команда оценила длину теломер в популяционной выборке, состоящей из переживших массовый голод начала 1920-х годов и потомков оставшихся в живых, которые были выходцами из Чувашии, сельской местности в Среднем Поволжье России.

В Чувашии доля голодающих жителей достигла 90 процентов в конце марта 1922 года, а смертность среди голодающих крестьян достигла 30-50%. Ситуация начала улучшаться только в апреле 1923 года. К концу того же года массовый голод в Чувашии был признан оконченным.

Исследователи сделали три основных открытия: (1) у мужчин, родившихся после 1923 г. после окончания массового голода, были более короткие теломеры лейкоцитов, чем у мужчин, родившихся до 1922 г .; (2) мужчины, рожденные в последующих поколениях, стабильно наследовали более короткие теломеры; и (3) отсутствовала какая-либо корреляция между более короткими теломерами и женщинами, родившимися до или после события.

«Это исследование, демонстрируя, что голод может сократить длину теломер, поднимает несколько вопросов», — сказал Кобылянский. «Влияет ли голодание на длину теломер в репродуктивных клетках взрослых сильнее, чем на лейкоциты детей? Является ли вызванное голоданием сокращение теломер зависимым от пола феноменом? И будут ли режимы голодания, оказывающие благотворное влияние, сопровождаться сокращением теломер у потомков? »

Теперь команда надеется ответить на эти и другие вопросы.